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dd斑马鱼胚胎及肝脏细胞之

dd斑马鱼胚胎及肝脏细胞之

斑馬魚胚胎及肝臟細胞之 HMG CoA Reductase 基因表現之調控

Regulation of HMG CoA Reductase Gene Expression in Zebrafish Embryo and Zebrafish Liver ZF-L

Cell

蔡政潔

Cheng-Chieh Tsai

生理學研究所

關鍵詞:

斑馬魚;胚胎;膽固醇;

Keyword:

HMG CoA Reductase;Zebrafish;sterol-sensing domain;SREBP;

摘要:

貳、 中文摘要 膽固醇是生物細胞膜重要的成份之一,同時也參與細胞的生長及發育。細胞

產生膽固醇的方式有兩種,包括內生性膽固醇及外生性的膽固醇。而在內生性膽固醇合成過

程中,3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG CoA reductase)

扮演著速率決定步驟,過去研究

指出,膽固醇合成過程中產生的一些中間媒介物質可調節 HMG CoA reductase 基因的表現。斑馬魚 (Danio rerio) 為胚胎發育、基因研究及人類疾病上常見的動物模式。我們將藉由斑馬魚之動

物模式,研究 HMG CoA reductase 基因的調節與膽固醇恆定。 首先,我們從斑馬魚 cDNA library 選

殖出 HMG CoA reductase。選殖出的斑馬魚 HMG CoA reductase 是由 3066 個鹼基構成,可換算成 884 個氨基酸;與人類 HMG CoA reductase 氨基酸序列相比較有 87﹪的一致性。預測 HMG CoA reductase 蛋白質,其 N 端是由一穿越內質網膜 6 次的跨膜區域所構成,C 端則是調節催化作用的催化位,且

包含 2 個 N-glycosylation sites。HMG CoA reductase 具有兩個功能區域:一為 sterol-sensing domain(SSD),

另一 C 端為催化區域。為了更進一步瞭解 HMG CoA reductase mRNA 在組織及胚胎發育過程中的分佈,我們萃取出斑馬魚成魚的所有 RNAs ,並選擇從未受精到受精 2 天之胚胎,利用 RT-PCR 分析發現 HMG CoA reductase mRNA 在斑馬魚各個組織中均有表現,然而在肝臟中表現最為顯著;而在胚胎時期 24-96 hpf,HMG CoA reductase mRNA 的表現呈現逐漸增加的現象。 除此之外,我們也以 ZF-L 細胞株進行研究亦偵測到 HMG CoA reductase mRNA 的表現。並利用此細胞株來瞭解降膽固醇藥物 lo

vastatin、compactin(HMG CoA reductase 的抑制劑)及 mevalonate (HMG CoA reductase 的中間產物)及25-hydro

xycholesterol (25-OHC),對 ZF-L 細胞中 HMG CoA reductase mRNA 表現的影響。結果發現,ZF-L細胞株

無論在處理 25-OHC 及 mevalonate,其 HMG CoA reductase mRNA 的定量結果與控制組相比較發現並沒有影響。相同的實驗結果亦發生在處理 lovastatin 及 compactin 後;因此 ZF-L 細胞株中的 HMG CoA reductase mRNA 表現不受 statins 類藥物及 mevalonate 的影響。綜合以上的研究結果,瞭解斑馬魚 HMG Co

A reductase 在成魚及胚胎皆有表現,可見維持膽固醇恆定之重要性,而藥物及膽固醇代謝產物對 ZF-L 細胞株之 HMG CoA reductase 基因的調節及表現是失去作用。

Abstract:

參、 英文摘要 Cholesterol is an essential component of animal cell membranes and maintains cell growth.Cell acquires cholesterol through endogenous biosynthesis or exogenous uptake. The rate-limiting reaction ofthe endogenous biosynthesis is catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMG CoAreductase). Regulation of the expression of HMG CoA reductase is by several intermediate products in thecholesterol biosynthetic pathways. Zebrafish (Danio rerio) has become a popular animal model for studyingdevelopment, genetics and human diseases. We are interested in role of HMG CoA reductase in zebrafishembryo cholesterol homeostasis. We first isolated a zebrafish cDNA encoding the HMG CoA reductaseinvolved in cholesterol biosynthesis. An HMG CoA reductase cDNA of 3066 bp, containing an open readingframe encoding 884 amino acids, shares 87﹪identical amino acids to human HMG CoA reductase. Thepredicted HMG CoA reductase protein consists of an amino-terminal membrane-bound region that predictedto span the endoplasmic reticulum membrane six times, and 2 N-glycosylation sites. There are twofunctional domains: SSD domain and catalytic domain. In order to determine which tissue and zebrafishembryo development stage expressing the HMG CoA reductase mRNA, we prepared total RNAs from adultzebrafish tissues and various stages. By using semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain

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