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标签蛋白融合技术概述:从分子生物学基础和生化基础到商用系统

K. Terpe

摘要: 随着蛋白质组学的迅猛发展,重组蛋白质的使用在近年来大大增加。重组杂合体含有一个多肽融合担体也就是亲和标签可用于辅助目标蛋白的纯化,这已经被广泛使用。许多不同的蛋白质,结构域或者肽类能与目标蛋白融合。利用融合蛋白的有助于重组蛋白纯化和检测这个优点被广泛赞同。然而,很难选择正确的纯化系统用于特定的目标蛋白。本综述概述了使用最频繁的和有趣的系统:精氨酸标签(Arg-tag),钙调蛋白结合肽(calmodulin-binding peptide),纤维素结合结构域(cellulose-binding domain),DsbA,c-myc-tag,谷胱甘肽S-巯基转移梅(glutathione S-transferase), FLAGtag,HAT-tag, His-tag, 麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein), NusA, Stag,SBP-tag, Strep-tag,和硫氧还蛋白等。 引言

生产高度纯化和性状确切的重组蛋白质已成为在医药工业工作的蛋白质化学家的主要任务,近年来,一些抗原表位的肽类和蛋白质已被用于大量生产重组蛋白质。这些亲和标签系统具有以下特征:(a)一步的吸附纯化,(b)对三级结构和生物活性影响小,(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质,(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确,(e)适用于大量的不同蛋白质。然而,每一个亲和标签都在其特定的缓冲液条件下纯化得到(表1)。因此有几种不同的策略用于大规模生产重组蛋白质。其中一种办法是使用很小的肽标签,这些标签不会与融合的蛋白质发生干扰。使用最为广泛的有多聚精氨酸,FLAG-,多聚组氨酸-, c-myc-, S-, and Strep II-tag. 对于某些应用,小标签无需去除。这些标签不像大标签具有免疫原性,经常可以直接作为抗原用于产生抗体。 小标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成 (Bucher etal. 2002)。另一种方法是使用大的肽类或蛋白质作为融合担体。大担体的使用可以增加目标蛋白的溶解性。缺点是对于一些应用如结晶或抗体产生等,标签必须加以去除。一般来说,对于特定的目标蛋白很难决定最佳的融合系统。这取决于目标蛋白本身(如稳定性,疏水性),表达系统,纯化后蛋白的用途。本综述概述了使用最频繁的和有趣的标签-蛋白融合系统(表2)。

多聚精氨酸-标签(Arg-tag)

精氨酸-标签最早在1984年首次描述(Sassenfeld和 Brewer 1984),通常由5或6个精氨酸组成。它已被成功用作细菌C末端标签,产生的重组蛋白质纯度高达95%,得率达到44%。精氨酸是碱性最强的氨基酸,带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大部分杂蛋白不结合。结合后,带标签的蛋白质在碱性pH下运行线性NaCl梯度洗脱得到。当C末端为疏水性区域时,多聚精氨酸可能影响蛋白质的三级结构(Sassenfeld和Brewer 1984). 来自Pyrococcus furiosus的带精氨酸标签的麦芽葡聚糖结合蛋白已获得结晶(Bucher et al.2002)。天然蛋白质的晶体在视觉上是分辨不出差别的,然而晶体在镶嵌图案和衍射图谱上有差别。精氨酸残基的C末端序列可用羧肽酶B处理去除。这一酶促处理已被成功用于一些例子,但常常由于低的切割得率或者在期望的蛋白质序列间发生不必要的切割而受到限制(Nagai和 Thogerson 1987)。精氨酸标签可用于在扁平表面固定化功能蛋白质;这对于研究其与配体的相互作用是重要的。GFP在其末端加上6个精氨酸标签可以通过这一序列可逆、专一结合到云母的表面,这已经作为电子扫描电镜应用的标准底物(Nock et al.1997)。 然而精氨酸标签并不常用,与第二标签联用是很有趣的蛋白质纯化工具。

多聚组氨酸-标签(His-tag)

已广泛采用的方法是利用固定化金属螯合层析纯化带有由多聚组氨酸残基组成的一个短的亲和标签的重组蛋白质。固定化金属螯合层析( IMAC; 由Porath et al. 1975提出)的基础是固定

2+2+2+2+在基质上的过渡态金属离子(Co, Ni,Cu, Zn)与特定的氨基酸侧链之间的相互作用。组氨酸

是与固定化金属离子作用最强的氨基酸,组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键。含有连续组氨酸残基序列的肽类可在IMAC中有效保留。基质材料洗涤之后,可通过调节柱缓冲液的pH或者添加游离咪唑洗脱含多聚氨基酸序列的肽类(表 1)。纯化带组氨酸残

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